Brzo otkrivanje uzročnika virusnog proljeva goveda u mlijeku iz spremnika pomoću kombinacije metoda umnožene rekombinazne polimeraze i test-traka za „lateral flow“ analizu

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is one of the most prevalent and economically important pathogens of ruminants, and leads to significant financial losses to the livestock industry worldwide. Development of rapid and accurate diagnostic methods is of great importance for the control and eradication of BVDV infection. The aim of this study was to develop a novel isothermal recombinase polymerase amplification (RPA) method combined with a lateral flow dipstick (LFD), for rapid detection of BVDV. RPA primers and a probe targeting the specific conserved 5′-UTR of BVDV genome were designed. The RPA amplification could be finished at a constant temperature of 38 0000C for 15 min, and the amplification product was easily visualized on a simple LFD within 5 min. The detection limit of this assay was 20 copies per reaction, and there was no cross-reactivity with other bovine infectious viruses, such as infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV), bovine enterovirus (BEV), bovine coronavirus (BcoV), bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV-3), bovine ephemeral fever virus (BEFV) and bovine respiratory syncytial virus (BRSV). The assay performance on bulk tank milk was also evaluated, and the sensitivity and accuracy of BVDV LFD RPA was compared with real-time RT-PCR. Of 284 pool or bulk tank milk samples, 51 were found to be positive by RPA assay, whereas 52 were positive by real-time RT-PCR. The coincidence rate between LFD RPA and real-time RT-PCR was 97.54% (277/284).Uzročnik virusnog proljeva goveda (BVDV) jedan je od najčešćih i ekonomski važnih patogena preživača koji uzrokuje znatne financijske gubitke u stočarskoj industriji širom svijeta. Razvoj brzih i točnih dijagnostičkih metoda iznimno je važan za kontrolu i iskorjenjivanje zaraze BVDV-om. Cilj ovog istraživanja bio je razviti novu metodu za brzo otkrivanje BVDV-a baziranu na kombinaciji metoda umnožene rekombinazne polimeraze i test-traka za „lateral flow“ analizu. Oblikovane su početnice i probe za umnažanje rekombinazne polimeraze usmjerene na specifični konzervirani 5’-UTR u genomu BVDV-a. Umnažanje se moglo završiti pri konstantnoj temperaturi od 38 °C tijekom 15 minuta i produkt umnažanja je lako vizualiziran na jednostavnoj test-traci za „lateral flow“ analizu unutar 5 minuta. Test je ograničen na 20 kopija po reakciji, pri čemu nije bilo križne reaktivnosti s drugim goveđim zaraznim virusima kao što su infektivni rinotraheitis virusa goveda (IBRV), goveđi enterovirus (BEV), goveđi koronavirus (BcoV), virus goveđe parainfluence tipa 3 (BPIV-3), virus gljivične ephemeralne groznice (BEFV) i goveđi respiratorni sincicijski virus (BRSV). Učinkovitost kombinacije navedenih metoda istražena je i s obzirom na usporedbu osjetljivosti odnosno točnosti koja se dobiva uporabom RT-PCR metode. Od 284 skupna uzorka mlijeka iz spremnika, kombinacijom metoda umnožene rekombinazne polimeraze i test-traka za „lateral flow“ analizu utvrđen je 51 pozitivan uzorak, a RT-PCR 52 pozitivna uzorka. Stopa podudarnosti između navedenih metoda bila je 97,54 % (277/284)